Conţinut
- Detectarea folosind modificările de culoare
- Folosind un cititor ELISA pentru măsurare
- ELISA direct competitiv (citocrom c)
- Incubați anticorpul primar în tuburi
Testul ELISA este un test imunosorbant legat de enzimă care utilizează anticorpi sau antigeni cuplați la o enzimă specifică pentru a ajuta la determinarea concentrației de anticorp sau antigen. Dacă luați o analiză ELISA și nu puteți utiliza anticorpi specifici pentru a obține rezultatele, se recomandă testul ELISA competitiv deoarece utilizează un antigen conjugat cu o enzimă în loc de anticorp și o metodă diferită de detectare.
Detectarea folosind modificările de culoare
Un protocol comun pentru testul ELISA competitiv este utilizarea unui anticorp primar neetichetat și purificat. Anticorpul acoperă godeurile unei plăci de microtitrare și este incubat cu standarde necunoscute. Un imunogen este apoi adăugat la conjugat cu anticorpul primar, care se va lega la situsurile de anticorp care nu sunt încă ocupate. Un substrat este apoi utilizat pentru a crea o schimbare a culorii pentru a măsura concentrația de legare.
Folosind un cititor ELISA pentru măsurare
Utilizați o placă de polistiren cu microtitrare și adăugați anticorpul primar în fiecare godeu. Pentru a obține legarea maximă, umpleți bine cu un microgram de anticorp. Se incubează placa timp de patru ore la temperatura camerei. Se adaugă anticorpul primar de captare și se spală godeurile cu PBS (soluție salină tamponată cu fosfat). Se incubează plăcile cu tampon de blocare timp de două ore la temperatura camerei. Se spală sondele de două ori cu PBS și se adaugă standardele. Plasați soluția de antigen-conjugat în godeuri și incubați din nou timp de două ore. Se spală din nou placa cu PBS de patru ori. Adăugați substratul și măsurați densitățile la lungimea de undă specifică utilizând un cititor ELISA.
ELISA direct competitiv (citocrom c)
Pentru o analiză ELISA directă competitivă, trebuie efectuată o analiză a diluției serice pentru antigenul utilizat în experiment. Placa de microtitrare este apoi acoperită cu citocrom c și este incubată peste noapte. Porțiunea ELISA din analiză este apoi efectuată prin adăugarea de reactiv de blocare și de anticorp secundar. Rezultatele absorbției sunt citite cu un cititor de microplăci.
Incubați anticorpul primar în tuburi
În această procedură, anticorpul primar este incubat în tuburi de testare în care antigenul de interes se leagă de el. Probele sunt apoi adăugate în godeurile plăcilor de microtitrare și incubate. Godeurile sunt apoi spălate pentru a îndepărta complecșii de antigen-anticorp nelegat și apoi se adaugă soluția de blocare pentru a preveni legarea celui de-al doilea anticorp la godeuri. Anticorpul secundar este apoi citit pe un cititor de plăci pentru a obține rezultatele.