Conţinut
Tehnicile de electroforeză separă moleculele ADN pe baza dimensiunilor lor; tehnicile similare pentru proteine le pot separa pe baza mărimii sau încărcării. În ambele cazuri, gelul prin care migrează moleculele se prepară utilizând o soluție tampon, o substanță chimică care acționează pentru a stabiliza pH-ul. Capacul îndeplinește mai multe roluri vitale în electroforeză.
curent
Gelul de electroforeză funcționează prin aplicarea unui curent electric pe placa de gel submersă în tampon. Moleculele ADN sunt încărcate negativ, iar proteinele pot fi încărcate negativ prin denaturarea lor mai întâi și apoi tratarea acestora cu dodecil sulfat de sodiu (SDS). Proteinele sau moleculele ADN migrează de la catodul încărcat negativ la anodul încărcat pozitiv. Apa, totuși, este un vehicul destul de sărac în curent - acesta transportă curent numai atunci când dizolvă substanțe în el, deoarece ionii încărcați se mișcă într-un câmp electric. Soluția tampon are o concentrație mai mare de ioni (putere ionică mai mare), astfel încât poate transporta mult mai mult curent decât apa pură.
Schimbarea PH
PH-ul măsoară concentrația ionului de hidrogen. Modificarea pH-ului poate schimba încărcarea netă a moleculelor, cum ar fi proteina sau ADN-ul, determinând o migrare mai lentă (sau mai rapidă). Acest lucru se datorează faptului că aceste molecule au părți de bază care acceptă ioni de hidrogen (protoni) și multe părți acide care pot dona protoni. Când un acid dă un proton, devine încărcat negativ; atunci când o bază acceptă un proton, dimpotrivă, acesta devine încărcat pozitiv. Pe măsură ce concentrația ionilor de hidrogen din soluție crește, proteinele și ADN-ul devin încărcate mai puțin negativ (sau mai mult încărcate pozitiv). PH-ul la care o moleculă, ca și proteina, nu are nicio sarcină se numește un punct izoelectric. Tampoanele stabilizează pH-ul în gel la un nivel în care ADN-ul va fi încărcat negativ și va migra așa cum se dorește.
Gel de stivuire
Tampoanele joacă un rol și mai complex într-un fel de electroforeză denumită SDS-PAGE sau dodecil sulfat de sodiu, electroforeză pe gel de poliacrilamidă. Aceasta este una dintre cele mai comune tehnici de analiză a proteinelor. Acestea sunt denaturate prin tratament termic și apoi acoperite cu dodecil sulfat de sodiu, și numai apoi adăugate la gel, care, în general, se execută pe verticală. Gelul are două regiuni, cel de stivuire (în partea superioară) și cel de a alerga dedesubt. Gelul de stivuire este preparat cu un tampon diferit, astfel încât pH-ul său să fie mai mic decât cel al gelului care rulează, în plus, are o rezistență ionică mai mică. Acesti doi factori provoaca stivuirea proteinei, asa ca merge tot in gelul de functionare in acelasi timp. Acest efect ajută la asigurarea separării proteinelor în gel în funcție de mărimea lor.
Cap electroforeza ADN
Cele două tampoane cele mai comune pentru electroforeza gelului ADN sunt EDTA tris-acetat și EDTA tris-borat, în care EDTA reprezintă acidul etilendiaminotetraacetic. Este important pentru că servește ca un chelator pentru ionii de magneziu, îndepărtându-i de soluție. Acești ioni sunt cofactori esențiali pentru enzimele numite ADN-uri care rupe ADN-ul, astfel încât EDTA în tampon funcționează ca o măsură de precauție suplimentară pentru a preveni orice probleme cu ADN-urile.