Conţinut
Lise este un cuvânt grecesc și înseamnă pur și simplu „a împărți” sau „a descompune”. Este o descriere bună a reacției care are loc cu celulele dintr-un tampon de liză, o soluție care le descompune pentru a extrage conținutul lor. Oamenii de știință folosesc aceste soluții pentru a extrage ADN sau proteine în analiza celulară, în special în cazul bacteriilor. Tipul de tampon de liza celulară variază în funcție de tipul de experiment, cu toate acestea vom menționa câteva alegeri comune.
Tampon și sare
Soluțiile tampon stabilizează pH-ul, în timp ce celulele sunt supuse procesului de liză. Soluția tris-HCL este cel mai comun tampon pentru tamponarea la pH 8, dacă pH-ul este dorit. HEPES este o altă soluție tampon comună în aceste experimente. Clorura de sodiu poate fi, de asemenea, adăugată pentru a crește puterea ionică, concentrația totală de substanțe dizolvate în afara celulelor. Acesta din urmă este important, deoarece apa se poate răspândi la toate membranele celulare, de la regiuni cu concentrație scăzută de solut la cele cu concentrație mare.
Detergent
Detergentul este ingredientul principal care dizolvă membrana celulară, astfel încât conținutul să poată scăpa. Detergenții sunt molecule amfipatice, adică cu un capăt care interacționează ușor cu moleculele de apă în timp ce celălalt capăt hidrofob, sau „care se teme de apă”, nu face acea interacțiune. Ele pot dizolva grăsimile formând micele, grupuri mici, în care cozile hidrofobe ale moleculelor de detergent îndreaptă spre moleculele de grăsime. Detergenții obișnuiți sunt dodecil sulfatul de sodiu sau SDS, NP-40 și tritonX.
Agenți și inhibitori chelatori
Tampoanele de liză conțin, de obicei, agenți chelatori, cum ar fi acidul etilen diaminetetraacetic (EDTA) sau acidul retilen glicol tetraacetic (EGTA). Aceste substanțe chimice se leagă de ioni metalici cu o încărcare de +2 (de exemplu, magneziu și calciu), făcându-i astfel indisponibili pentru alte reacții. Multe ADN-uri (proteine care mestecă ADN-ul) și proteaze (proteine care taie alte proteine) au nevoie de ioni de magneziu pentru a funcționa, așadar, privându-le de acest ingredient principal, EDTA și EGTA, acestea ajută la reducerea nivelului de protează sau a activității DNAse. Cu toate acestea, ele nu le exclud complet și unele proteaze nu depind de cofactorii de magneziu, astfel încât tampoanele de liză conțin uneori și substanțe numite inhibitori de protează, care se leagă de acesta și îi împiedică să funcționeze corect.
Liză alcalină
Liza alcalină este o tehnică foarte comună pentru purificarea plasmidelor de bacterii. Această metodă implică utilizarea a trei soluții. Primul conține glucoză, tampon tris-HCL, EDTA și ARN-uri. Glucoza creează o concentrație ridicată de substanță dizolvată în afara bacteriilor, astfel încât acestea să devină ușor flasc, facilitând procesul de liză. EDTA și tris-HCL funcționează așa cum s-a descris anterior, în timp ce RNAse va mesteca orice ARN din interiorul celulei pentru a-l scoate din cale. A doua soluție face efectiv liza celulară. Conține detergent SDS și NaOH, care ridică pH-ul la 12 sau mai mult, denaturând proteinele din interiorul celulei și determinând ADN-ul să se separe în filamente simple. A treia soluție conține acetat de potasiu pentru a restabili pH-ul la un nivel mai neutru, astfel încât firele de ADN plasmidice să se poată uni. Între timp, proteinele denaturate se reunesc și precipită, în timp ce ionii de dodecil sulfat se unesc cu ionii de potasiu pentru a forma un compus insolubil, care poate precipita și din soluție.